Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist eine etablierte Technik zur Trennung von Stoffgemischen in ihre Einzelbestandteile auf Grundlage spezifischer chemischer und molekularer Eigenschaften. Die Trennung von Flüssigkeiten basiert auf der Aufteilung der gewünschten Analyten zwischen einer mobilen Phase (Elutionsmittel) und einer stationären Phase.
Diese stationäre Phase ist in der HPLC-Säule enthalten, und eine den Analyten enthaltende Probe wird auf die Säule injiziert und dann mit einem Strom der mobilen Phase durchgepumpt. Beim Durchlaufen der Säule interagieren die Bestandteile unterschiedlich mit der stationären Phase, wodurch sie sich zu verschiedenen Zeiten von der Säule trennen und eluieren. Diese abgetrennten Substanzen werden typischerweise mit HPLC-Detektoren nachgewiesen.
Ein grundlegendes analytisches HPLC-System umfasst mehrere Komponenten, darunter einen Elutionsmittelreservoirs, eine Pumpe, ein Injektionsventil, eine HPLC-Säule, ein Detektor und einen PC mit einem installierten Flüssigchromatographie-Datensystem. In diesem Blogbeitrag geht Knauer detaillierter auf die Funktionsweise der einzelnen wesentlichen Flüssigkeitschromatographiemodule ein.
HPLC-Pumpen und Elutionsmittelbehälter
Es gibt zwei primäre Modi, die zum Pumpen der mobilen Phase durch ein HPLC-System verwendet werden. Eine isokratische Elution wird verwendet, wenn die mobile Phase während eines Laufs konstant bleibt, beispielsweise wenn das Elutionsmittel recycelt wird. Gradientenelutionssysteme werden ringesetzt, wenn sich die Zusammensetzung des Elutionsmittels während der Trennung ändert.
Das Nachweissignal eluierter Substanzen wird als Peak bezeichnet. Die Anwendung eines Gradienten ermölicht es spätere Peaks in einem Chromatogramm schneller zu eluieren als im isokratischen Modus, indem die Zusammensetzung der mobilen Phase entsprechend geändert wird.
In einem Gradientenelutionssystem können sowohl Hochdruck- als auch Niederdruckgradienten (HPG / LPG) verwendet werden. Mit Flüssiggas können Lösungsmittel aus verschiedenen Vorratsbehältern entnommen und auf der Saugseite der Pumpe gemischt werden, während HPG mehrere Pumpen verwendet, um einzelne Lösungsmittelströme zum Mischen auf der Auslassseite zuzuführen.
Hochleistungsflüssigchromatographiesäulen
Die HPLC-Säule ist das Fundament dieses Instruments. Es enthält die Medien der stationären Phase, die zur Trennung der Probenbestandteile in ihre Bestandteile erforderlich sind. Die Geometrie ist ein wichtiger Leistungsindikator für HPLC-Säulen. Innendurchmesser und Länge beeinflussen die Retentionsraten und Elutionszeiten ebenso wie die Partikelgröße und die chemische Zusammensetzung der stationären Phase. Zahlreiche Trennungsmechanismen werden durch HPLC-Säulen unterstützt, darunter Normal- und Umkehrphase, Größenausschluss, Ionenaustausch, hydrophile Wechselwirkung, Affinität und mehr.
Eine stabile Säulentemperatur ist ein weiterer entscheidender Faktor für reproduzierbare Trennergebnisse und gleichbleibende Retentionsraten zu erlzielen. Säulenthermostate werden eingesetzt, um stabile Temperaturen aufrechtzuerhalten und eine gleichmäßige Temperaturverteilung zwischen Heizmanschetten und Eluentenheizungen zu gewährleisten.
Flüssigkeitschromatographie-Detektoren und Software
Die Art des Detektors, der zum Erfassen von Peaks verwendet wird, wird vom Analyten bestimmt. Es stehen verschiedene HPLC-Detektionsprinzipien zur Verfügung, von denen einige hier beschrieben werden: UV-Detektoren sind üblich, erfordern jedoch Substanzmoleküle, um Licht im ultravioletten Teil des Spektrums zu absorbieren. Ein RI-Detektor wird verwendet, wenn Substanzen kein UV-Licht absorbieren. Diese Detektoren werden verwendet, um die Signalspitzen der einzelnen Analyten über die Zeit zu messen, können aber nur für isokratische Anwendungen verwendet werden. Der vollständige Satz von Peaks wird als Chromatogramm bezeichnet. Dieses wird vom chromatographischen Datensystem erzeugt, wenn der Detektor das RI- oder UV-Signal in einen elektrischen Wert umwandelt. Jeder einzelne Peak liefert sowohl qualitative als auch quantitative Informationen über den Analyten, und das Datenverwaltungssystem kann anschließend die Zusammensetzung der Probe berechnen.
Flüssigkeitschromatographie mit Knauer
Knauer verfügt über mehr als fünfzig Jahre Erfahrung in der Entwicklung und Herstellung fortschrittlicher wissenschaftlicher Werkzeuge und flüssigkeitschromatographischer Instrumente. Wir kennen die besonderen Herausforderungen von HPLC / UHPLC und können geeignete Methoden und Techniken für die Analyse Ihrer proprietären Analyten vorschlagen.
